Rozmnażanie roślin „in vitro”, czyli jak powstają rośliny akwariowe w laboratorium

Autor: Mariusz Pożoga (www.laboratorium313.pl)

Słowniczek:

Akseniczność – brak niepożądanych organizmów, w naszym przypadku, w kulturze in vitro.
Eksplantat – część rośliny przeniesiona do kultury in vitro.
Endomikroorganizmy – mikroorganizmy żyjące wewnątrz innych organizmów. W przypadku bakterii są to endobakterie, w przypadku grzybów endogrzyby.
Kallus – tkanka przyranna, masa nieuorganizowanych, szybko dzielących się komórek
Pożywka – medium hodowlane, w akwarystyce żel. Zbiór makro- i mikroelementów, często wzbogacona w hormony roślinne i inne substancje stymulujące rozwój roślin w kulturze in vitro.
Proliferacja – proces namnażania komórek
Totipotencja – zdolność komórki do podziału i różnicowania w dowolne typy komórek
Zmienność somaklonalna – występowanie różnic w organizmach powstałych w wyniku klonalnego rozmnażania.

ROZMNAŻANIE ROŚLIN „IN VITRO”, CZYLI JAK POWSTAJĄ ROŚLINY AKWARIOWE W LABORATORIUM

Kultury in vitro (łac. w szkle) to technologia pozwalająca utrzymywać i namnażać linie komórek, tkanek, a także otrzymywać z dużą wydajnością sadzonki roślin w sterylnych warunkach, przy pomocy odpowiedniego medium hodowlanego (pożywki, nazywanej w akwarystyce żelem). Na nich opiera się znaczna część produkcji roślinnej na świecie. Również większa dostępność, głównie cenowa, wielu gatunków roślin jest spowodowana upowszechnieniem technologii kultur in vitro. Pozwalają one uzyskiwać sadzonki w krótszym czasie i niższym kosztem. Właśnie dlatego w domach tak często widujemy storczyki, a w ogrodach magnolie. Niegdyś rośliny trudno dostępne i drogie – dziś praktycznie każdy może sobie na nie pozwolić.

Historia kultur in vitro (można spotkać się również z określeniami kultury tkankowe, uprawa in vitro oraz hodowla in vitro) sięga początku XX wieku, kiedy w 1902 roku niemiecki fizjolog Gottlieb Haberlandt zaproponował stworzenie kultury komórek w sztucznych warunkach – in vitro. Wyizolował pojedyncze komórki z różnych gatunków roślin i jako pierwszy zmusił je do wzrostu. Nie udało mu się jednak wywołać podziału. Haberlandt dzięki swojej pracy i tezom na temat czynników wpływających na kulturę nazywany jest ojcem kultur tkankowych. Stworzył mocne podwaliny do dalszych prac. Wiele z jego przypuszczeń w przyszłości zostało potwierdzone przez innych badaczy. Przez długi okres roślinne kultury in vitro były daleko w tyle za kulturami zwierzęcymi. Jednak odkrycie hormonów roślinnych dodało naukowcom stymulującego bodźca. Badania zaczęły rozwijać się coraz szybciej. Odkryto, że z utrzymywanej w kulturze tkanki przyrannej (kallusa) można uzyskać organogenezę – wytwarzanie organów rośliny. Co więcej, kultury można utrzymywać w warunkach in vitro wiele miesięcy. W 1962 roku Murashige i Skoog stworzyli używaną do dziś bardzo często pożywkę MS. Służyła ona początkowo do prowadzenia kultur tytoniu. Obecnie używa się jej w prawie każdym laboratorium badawczym. Oprócz uzyskiwania sadzonek roślin kultury in vitro oferują zapylanie in vitro, otrzymywanie mieszańców międzygatunkowych, nowych odmian roślin ozdobnych, uwalnianie roślin od patogenów, a nawet kultury korzeni włośnikowatych produkujących metabolity wtórne – często substancje cenne w lecznictwie.

Kultura korzeni włośnikowatych ogórka. Zdjęcie wykonane do mojej pracy inżynierskiej.

Mikropropagacja (mikrorozmnażanie, szeroko pojęte otrzymywanie sadzonek drogą kultur in vitro) jest w obecnych czasach powszechnie używaną metodą klonalnego rozmnażania roślin. Można używać w tym celu różnych komórek, tkanek, czy organów. Podstawą kultur in vitro jest totipotencja komórek. Oznacza ona, że każda komórka roślinna ma nieograniczone zdolności do podziałów i różnicowania się w inne typy komórek. Mówi się też, że koniecznym wymogiem prowadzenia kultur in vitro jest aseptyczność, czyli zachowanie sterylności tkanek lub organów w szczelnie zamkniętych pojemnikach. Należy jednak mieć świadomość, że wiele kultur może prawidłowo wzrastać pomimo obecności w tkance grzybów lub bakterii. Nie znajdują się one na powierzchni eksplantatu (wybranego fragmentu rośliny, z którego uzyskujemy kulturę), lecz wewnątrz. Są to endobakterie i endogrzyby. Dopóki roślina jest silna i jej komórki dzielą się szybko, uzyskując ogólny wzrost pędów, endomikroorganizmy nie ujawniają się. Dopiero, gdy tkanka roślinna słabnie (znajdzie się w obliczu niedoboru substancji odżywczych lub zbyt długo znajduje się w kulturze) endomikroorganizmy mogą ‘wyjść’ z tkanek roślinnych. Wtedy, zamiast żyć w roślinie i z niej czerpać substancje pokarmowe, zaczynają wykorzystywać roślinne medium hodowlane. Komórki mikroorganizmów dzielą się znacznie szybciej niż komórki roślin. Dlatego kultura może zostać szybko przejęta przez niechciane mikroorganizmy. Komórki roślinne nie dzielą się już tak szybko jak powinny, bakterie i grzyby zaczynają na nich rosnąć, wydzielają substancje allelopatyczne do pożywki, zabierając zarazem substancje odżywcze. Uzyskujemy w ten sposób zakażenie mikrobiologiczne. Kultura zakażona powinna zostać zutylizowana (nie wolno jej otwierać), aby w laboratorium nie zwiększać udziału mikroorganizmów, które mogą zaatakować kolejne kultury.

Przykład zakażenia bakteryjnego.

Przykład zakażenia bakteryjnego.

Każda roślina ma inne wymagania pokarmowe. Z tego względu mieszanina soli używanych do sporządzenia pożywki różni się dla poszczególnych rodzajów roślin, gatunków, a nawet odmian. Przykładowo różanecznikom dedykowana jest pożywka Andersona, roślinom o zdrewniałej łodydze WPM, itd. Najbardziej uniwersalną i najczęściej stosowaną pożywką jest wspomniana już wyżej pożywka MS (Murashige & Skoog, 1962). Pożywki mogą mieć różny stan skupienia. Mogą być płynne, półpłynne bądź zestalone, w zależności od potrzeby użycia. Pożywki stałe są najczęściej stosowane w przemysłowej mikropropagacji. Pożywek płynnych używa się np. w kulturach zawiesinowych, w bioreaktorach. Mogą to być kultury korzeniowe, komórek embriogenicznych. Obecna technologia daje możliwość użycia szeregu syntetycznych, bądź naturalnych środków zestalających. Naturalnym środkiem zestalającym jest agar, pozyskiwany z morskich krasnorostów. Popularnymi syntetycznymi zamiennikami są Gelrite i Phytagel. Cechują się one szybszym procesem zestalania oraz dodaje się ich znacznie mniej na jednostkę objętości niż agaru.

Bardzo często do pożywek dodaje się również hormony. Najczęściej są to auksyny (kwas indolilo-3-octowy –IAA; kwas indolilo-3-masłowy- IBA; kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy- 2,4-D), cytokininy (kinetyna – Kin; 6- benzylaminopuryna – BAP) oraz gibereliny (kwas giberelinowy- GA3). Każda grupa hormonów odpowiada za odmienne procesy. Pewne hormony odpowiadają za wytwarzanie nowych pędów i ich wydłużanie, inne za ukorzenianie. Powinno dobierać się takie proporcje hormonów, aby zapewnić najszybszy i najbardziej wydajny wzrost pędów.

Pożywka powinna mieć też odpowiednie pH. Dobiera się zazwyczaj lekko kwaśne. W takim pH lepiej rozpuszczają się sole oraz obserwuje się lepszy wzrost roślin. Przygotowana mieszanina soli, hormonów oraz innych dodatków musi zostać wysterylizowana. Sterylizacja odbywa się w autoklawie. W przypadku składników termoniestabilnych niezbędne jest dodanie ich już po autoklawowaniu. Przykładem takich substancji są antybiotyki, służące do walki z zakażeniami w kulturach. Zostają one dodane w komorze laminarnej. W takich właśnie komorach prowadzi się pracę z kulturami. Jest to maszyna zawierająca przestrzeń, przez którą przepływa filtrowane powietrze. Odpowiedni system filtracji daje gwarancję, że powietrze w komorze nie zawiera komórek bakterii, grzybów, a nawet w bardziej wydajnych filtrach wirusów. Istnieją komory różnej klasy. Komory pierwszej klasy chronią tylko materiał wewnątrz komory. Zasysa ona powietrze z laboratorium, filtruje, by następnie sterylne już powietrze dostało się do wnętrza komory. Komory drugiej klasy, oprócz powietrza wewnątrz komory, filtrują także powietrze w laboratorium. Chronią zatem użytkownika. Najczęściej stosuje się je w pracy z groźnymi dla ludzi drobnoustrojami w kulturach in vitro zwierząt i ludzi. Komory mogą być również dzielone ze względu na sposób przepływu powietrza, na komory z pionowym lub poziomym przepływem powietrza.

Do pracy w komorze potrzebne jest kilka podstawowych narzędzi. Oprócz zestawu pincet oraz skalpeli używanych do bezpośredniego kontaktu z tkanką, potrzebny jest przyrząd do sterylizacji narzędzi – palnik (opala się narzędzia w stożku ognia. Tam temperatura jest największa i osiągana przeszło 6000C) lub sterylizator kulkowy (sterylizacja kilka minut w temperaturze  >2000C), naczynie na zlewki płynu pokulturowego, bądź odpady stałe, sterylne szalki Petriego, na których układa się materiał roślinny.

Mikrorozmnażanie można prowadzić różnymi technikami – za pomocą regeneracji bezpośredniej, pośredniej lub somatycznej embriogenezy (choć niektórzy nie uznają jej za metodę mikropropagacji). Regeneracja bezpośrednia polega na odtworzeniu organu rośliny bezpośrednio z tkanki, bez udziału tkanki przyrannej (kallusa). Jako eksplantat najczęściej wykorzystuje się uśpione pąki boczne. Dzięki działaniu cytokinin, bądź cytokinin i auksyn jednocześnie, komórki pąka bocznego zmuszane są do podziałów, co w rezultacie skutkuje powstaniem pędów. W zależności od zastosowanych hormonów może rozwinąć się od jednego pędu, tak jak dzieje się to w naturze, do nawet kilkudziesięciu. Na jednej roślinie znajduje się co najmniej jeden węzeł zawierający pąki boczne. Używając kilku węzłów jednej rośliny i posiadając zoptymalizowaną metodykę mikrorozmnażania możemy z jednej rośliny uzyskać kilkaset nowych. Należy jednak liczyć się z tym, że im więcej pędów otrzymujemy z jednego pąka bocznego, tym większe ryzyko wystąpienia zmienności somaklonalnej, opisanej w dalszej części artykułu.

 Praca przy mikrorozmnażaniu. Czerwonymi strzałkami zaznaczono śpiące pąki boczne.

Praca przy mikrorozmnażaniu. Czerwonymi strzałkami zaznaczono śpiące pąki boczne.

Przy mikrorozmnażaniu bezpośrednim wykorzystuje się też pąki wierzchołkowe. Wycina się
fragment rośliny o długości od kilku milimetrów do kilku centymetrów, zawierający taki pąk, a następnie umieszcza w pożywce. W ten sposób uzyskujemy z jednego pąka jedną roślinę. Metoda ta jest mało efektywna, ale ma swoje zalety. Dzięki niej można wyeliminować z rośliny wirusy. Wycinając odpowiednio mały fragment pąka (mniejszy niż 1mm) jest szansa na to, że jego komórki będą wolne od wirusów. Następnie tak powielana roślina jest w 100% zdrowa. Bardzo ciekawym zjawiskiem jest również wykształcanie pędów przybyszowych bezpośrednio z tkanki liści czy łodyg. Takie pędy można bardzo łatwo ukorzenić, a następnie użyć jako sadzonki.

Eksplantaty można zmusić również do produkcji tkanki przyrannej – kallusa. Komórki odróżnicowują się w komórki kallusa, następnie intensywnie proliferują (namnażają się), by w końcowym etapie wytworzyć pędy. Jest to mikrorozmnażanie pośrednie, ponieważ pojawia się faza tkanki kallusowej. We wcześniej opisanych metodach nie występowała. Moim zdaniem jest to metoda warta uwagi. Z małej grudki kallusa można wytworzyć od kilkunastu do kilkudziesięciu pędów. Mankamentem jest jednak występowanie zmienności somaklonalnej podczas regeneracji. Trzeba dodatkowo przeprowadzić selekcję fenotypów, które nas interesują – tych, które są identyczne z rośliną mateczną. Uzyskane zmienione pędy należy odrzucić, a zostawić prawidłowe.

Kallus z regenerującymi pędami.

Kallus z regenerującymi pędami.

Somatyczna embriogeneza polega na powstawaniu zarodków z komórek somatycznych (z komórek wegetatywnych rośliny), a nie z komórki plemnikowej i jajowej. Tutaj również możemy zastosować podział na pośrednią i bezpośrednią somatyczną embriogenezą. Pośrednia wymaga wytworzenia kallusa embriogenicznego, natomiast bezpośrednia tworzy zarodki prosto z tkanki. Powstałe zarodki z komórek somatycznych przechodzą podobne fazy rozwojowe, które przechodzą zarodki zygotyczne. Istnieje jednak kilka ważnych różnic. U zarodków somatycznych stadium globularne jest większe niż u zarodków zygotycznych i nie wykształca się suspensor. Suspensor odpowiedzialny jest za syntezę hormonów oraz dostarcza substancje odżywcze. W warunkach in vitro jego rolę pełni pożywka. Co więcej nie wytwarzane jest bielmo, ani okrywa nasienna. Zarodki somatyczne różnią się także zawartością wody. Mają jej znacznie więcej niż zarodki zygotyczne, które przed przejściem w stan spoczynku muszą przejść proces odwodnienia. Zarodki somatyczne mogą mieć także zmienioną liczbę oraz morfologię liścieni. Somatyczna embriogeneza jest również bardzo wydajnym sposobem powielenia materiału roślinnego.

Przybliżę nieco temat wspomnianej wcześniej zmienności somaklonalnej. Nazwa ta wywodzi się od komórek somatycznych, czyli wegetatywnych, które stanowią materiał wyjściowy do mikorozmnażania oraz klonów, którymi są otrzymane rośliny. Teoretycznie w kulturach  in vitro nie powinno obserwować się żadnej zmienności. Nie występuje przecież łączenie gamet osobników rodzicielskich, ani corssing-over w mejozie. Cechy rośliny potomnej powinny zostać zachowane. Mimo to możemy zaobserwować odchylenie od cech rośliny matecznej. Przyczyną mogą być między innymi mutacje DNA i zmiany metylacji DNA (zmienność epigenetyczna). Zmienność na poziomie metylacji jest na ogół odwracalna. Pędy, które wyrosną z pąków śpiących zmienionej rośliny, z dużym prawdopodobieństwem nie będą posiadały niechcianych cech. Mutacje DNA są znacznie trwalsze. Zmienność może także wynikać z tego, iż komórki tej samej rośliny mogą być niejednorodne genetycznie. Wynika to z zaburzeń powstałych podczas podziałów komórkowych oraz replikacji DNA. Zmienia się ploidalność komórek. Podczas wprowadzania rośliny do kultury mogą się aktywować odmienne programy rozwojowe, charakterystyczne dla poszczególnych komórek. Szczególnie duża zmienność jest generowana przez kallus. Każda regeneracja pośrednia niesie ze sobą duże ryzyko uzyskania somaklonów. Na szczęście bardzo często są to odwracalne mutacje epigenetyczne.

Przykład zmienności somaklonalnej. Zmieniona liczba liści w okółku u Bacopy monnieri. Zamiast dwóch liści widoczne są trzy. Podczas prac z tym gatunkiem zdarzały się pędy posiadające także cztery lub więcej liści w okółku.

Przykład zmienności somaklonalnej. Zmieniona liczba liści w okółku u Bacopy monnieri. Zamiast dwóch liści widoczne są trzy. Podczas prac z tym gatunkiem zdarzały się pędy posiadające także cztery lub więcej liści w okółku.

Tak w dużym skrócie wygląda produkcja ‘roślin w żelu’. Można łatwo wywnioskować, że rośliny akwariowe pochodzące z kultur in vitro posiadają wiele zalet. Pomijam tu powtarzane przez wszystkich slogany „dużo roślin w niskiej cenie”, czy  „brak ślimaków i zarodników glonów”. Przede wszystkim są to rośliny będące klonami wyselekcjonowanych, najlepszych okazów roślin akwariowych. Rosnąc na odpowiedniej pożywce są znakomicie odżywione i posiadają zapas substancji pokarmowych potrzebnych do szybkiego wzrostu po aklimatyzacji w akwarium. Dzięki sterylizacji eksplantatów nie przeniesiemy wraz z roślinami chorób ryb, ani żadnych pasożytów. Rośliny w koszyczkach nie dają tej pewności. Co więcej do akwarium nie dostaną się sinice (cyjanobakterie). Przy zakwitach cyjanobakterii może dojść do intensywnego wydzielania cyjanotoksyn. Mają one działanie endo-, neuro- i hepatotoksyczne. Są akumulowane w organizmach żywych. Każde wyższe ogniwo łańcucha pokarmowego jest coraz bardziej narażone na ich działanie ze względu na progresywną kumulację toksyn.

Spotykam się często z pytaniami jak postępować z roślinami in vitro i jak je sadzić. Procedura jest dość prosta. Należy wyjąć rośliny z kubeczka i pod bieżącą wodą o temperaturze pokojowej wypłukać pożywkę. Dokładne wypłukanie jest ważne ze względu na to, że zużyte medium w akwarium stanie się pożywką dla drobnoustrojów. Często pojawia się na nim pleśń. Wypłukane kępy roślin następnie dzieli się na porcje, sadzonki i umieszcza w podłożu. Rośliny bardzo szybko powinny się zaaklimatyzować i rozpocząć wzrost.

Rośliny akwariowe in vitro już od kilku lat dostępne są na polskim rynku akwarystycznym. Mimo to wiele osób nie wie, czym tak naprawdę są „rośliny w żelu” i nie zna ich zalet. Mam nadzieję, że powyższy artykuł przybliżył Państwu tematykę kultur in vitro i ich praktycznego zastosowania w akwarystyce.